本发明公开了一种生物催化制备石墨烯的方法,该方法包括如下步骤:(1)将枯草芽孢杆菌B168活化,离心收集菌体,用M9简单培养基重悬;(2)将步骤(1)中所得的枯草芽孢杆菌菌体与氧化石墨烯悬浮液混合,并加入电子介体维生素K
1.一种生物催化制备石墨烯的方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:(1)将枯草芽孢杆菌B168活化,离心收集菌体,用M9简单培养基重悬;(2)将步骤(1)中所得的枯草芽孢杆菌菌体与氧化石墨烯悬浮液混合,并加入电子介体维生素K₃的溶液,进行生物还原反应;(3)将步骤(2)中经过生物还原反应的混合体系静置、离心后得到石墨烯,经清洗、沉淀,冷冻干燥后得到成品;步骤(2)中,生物还原反应的条件为:厌氧条件下培养0.5-10h,温度为25-37°C。
2.根据权利要求1所述的生物催化制备石墨烯的方法,其特征在于,步骤(1)中,枯草芽孢杆菌B168的活化条件为:将菌种接种到固体培养基上,在37°C的恒温培养箱中活化12h,用接种环挑取单菌落于5mL液体培养基中,37°C、200rpm/min的恒温摇床培养12h;活化所用的固体培养基成分为:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,NaClxa010g/L,可溶性淀粉10g/L,琼脂粉18g/L;活化所用的液体培养基为:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,NaClxa010g/L,可溶性淀粉10g/L,溶剂为水。
3.根据权利要求1所述的生物催化制备石墨烯的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的M9简单培养基成分为:Na₂HPO₄·7H₂Oxa012.8g/L,K₂HPO₄3g/L,NaClxa00.5g/L,NH₄Clxa01g/L,MgSO₄
0.24g/L,CaCl₂
0.0111g/L,葡萄糖4g/L,溶剂为水。
4.根据权利要求1或3所述的生物催化制备石墨烯的方法,其特征在于,步骤(1)中,活化后的枯草芽孢杆菌B168用M9简单培养基清洗、重悬,控制菌体的OD₆₀₀=0.2-1.0。
5.根据权利要求1所述的生物催化制备石墨烯的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的氧化石墨烯悬浮液,溶剂为无菌水,溶质氧化石墨烯的浓度为2.5-10mg/mL;所述的氧化石墨烯悬浮液预先经过超声分散处理,超声时间为40-120min,超声温度为室温。
6.根据权利要求1所述的生物催化制备石墨烯的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的维生素K₃的溶液,溶剂为无水乙醇、氯仿或四氯化碳;溶质维生素K₃的浓度为1-5mg/mL。
7.根据权利要求1所述的生物催化制备石墨烯的方法,其特征在于,步骤(2)中,枯草芽孢杆菌菌体与氧化石墨烯悬浮液混合的体积比为1:10-20,电子介体维生素K₃的终浓度为1-5μg/mL。
8.根据权利要求1所述的生物催化制备石墨烯的方法,其特征在于,步骤(3)中,离心方法为:离心转速8000-12000r/min,离心时间15-80min;清洗方法为:依次采用稀盐酸、乙醇和水反复清洗,其中稀盐酸的浓度为0.1-5mol/L,乙醇的体积百分浓度为70%~80%;冷冻干燥方法为:干燥温度为-20~-80°C,真空度≤160Pa,干燥时间为12-24h。技术领域
本发明涉及一种用生物催化法还原氧化石墨烯制备石墨烯的方法,属于生物材料领域。
背景技术
石墨烯是一种新型的二维纳米材料,是已知的世上最薄、最坚硬的纳米材料,它几乎是完全透明的。由于石墨烯具有高的比表面积、突出的导热性能和力学性能及其非凡的电子传递性能等一系列的优异的性质,所以制备高质量和高产量的石墨烯一直是人们关注的焦点。石墨烯的研究热潮也吸引了国内外材料制备研究的兴趣,石墨烯材料的制备方法已报道的有:机械剥离法、化学氧化法、晶体外延生长法、化学气相沉积法、有机合成法和碳纳米管剥离法等。氧化-还原法制备成本低廉且容易实现,目前被认为是制备石墨烯的最佳方法。即石墨氧化变成氧化石墨,再在超声条件下得到分散的氧化石墨烯溶液,再通过化学还原剂还原获得石墨烯。但它的缺点是宏量制备容易带来废液污染和制备的石墨烯存在一定的缺陷等问题。在还原氧化石墨烯过程中,为了减少环境污染,提高石墨烯性能,微生物还原开始引起人们的关注,目前已发现的有希瓦氏菌(Shewanella),大肠杆菌(Escherichiaxa0coli),节杆菌(Latinxa0Namexa0Arthrobacterxa0sp.Connxa0andxa0Dimmick)等等。已有很多相关文献报道,希瓦氏菌可以用来还原氧化石墨烯为石墨烯,而且有很好的效果(如Everettxa0C.Salas发表的Reductionxa0ofxa0Graphenexa0Oxidexa0viaxa0Bacterialxa0Respiration;Guangfeixa0Liu发表的Quinone-mediatedxa0microbialxa0synthesisxa0ofxa0reducedxa0graphenexa0oxidexa0withxa0peroxidase-likexa0activity)。虽然希瓦氏菌法制备的石墨烯相对于化学法制备的在结构和性能上有很大的进步,但它是人畜共患的条件致病菌,通常分布于淡水和海洋中。它对环境安全有一定的潜在威胁,对生物还原制备石墨的扩大化有一定的制约性,而且在制备石墨烯的过程中必须将废弃的希瓦氏菌进行集中灭菌处理,这增加了制备过程的步骤。Satyanarayanaxa0Reddy等人研究(Biologicalxa0Synthesisxa0ofxa0Goldxa0andxa0Silverxa0Nanoparticlesxa0Mediatedxa0byxa0thexa0Bacteriaxa0Bacillusxa0Subtilis)表明,枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)可以分泌一些蛋白,能够使氯金酸盐和银离子发生氧化还原反应生成金纳米粒子和银纳米粒子。而且它是一类重要的工业用微生物,主要用于各类工业用酶制剂的表达生产。因其有长期制备发酵食品的历史,是非致病的一种非病原微生物,不产毒素和致热致敏蛋白质,故为一种食品安全的菌种。相对于希瓦氏菌而言,更为安全可靠。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种生物催化制备石墨烯的方法。为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:一种生物催化制备石墨烯的方法,该方法包括如下步骤:(1)将枯草芽孢杆菌B168活化,离心收集菌体,用M9简单培养基重悬;(2)将步骤(1)中所得的枯草芽孢杆菌菌体与氧化石墨烯悬浮液混合,并加入电子介体维生素K₃的溶液,进行生物还原反应;(3)将步骤(2)中经过生物还原反应的混合体系静置、离心后得到石墨烯,经清洗、沉淀,冷冻干燥后得到成品。步骤(1)中,所述的枯草芽孢杆菌B168为ATCC-23857。步骤(1)中,枯草芽孢杆菌B168的活化条件为:将菌种接种到固体培养基上,在37°C的恒温培养箱中活化12h,用接种环挑取单菌落于5mL液体培养基中,37°C、200rpm/min的恒温摇床培养12h;活化所用的固体培养基成分为:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl10g/L,可溶性淀粉10g/L,琼脂粉18g/L;活化所用的液体培养基为:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl10g/L,可溶性淀粉10g/L,溶剂为水。步骤(1)中,所述的M9简单培养基成分为:Na₂HPO₄·7H₂Oxa012.8g/L,K₂HPO₄3g/L,NaCl0.5g/L,NH₄Cl1g/L,MgSO₄0.24g/L,CaCl₂0.0111g/L,葡萄糖4g/L,溶剂为水。步骤(1)中,活化后的枯草芽孢杆菌B168用M9简单培养基清洗、重悬,控制菌体的OD₆₀₀=0.2-1.0。步骤(2)中,所述的氧化石墨烯悬浮液,溶剂为无菌水,溶质氧化石墨烯的浓度为2.5-10mg/mL;所述的氧化石墨烯悬浮液预先经过超声分散处理,超声时间为40-120min,超声温度为室温。步骤(2)中,所述的维生素K₃的溶液,溶剂为乙醇、氯仿或四氯化碳;溶质维生素K₃的浓度为1-5mg/mL;若长时间不用,可在4°C下保存。步骤(2)中,枯草芽孢杆菌菌体与氧化石墨烯悬浮液混合的体积比为1:10-20,电子介体维生素K₃的终浓度为1-5μg/mL。步骤(2)中,生物还原反应的条件为:厌氧条件下培养0.5-10h,温度为25-37°C。步骤(3)中,离心方法为:离心转速8000-12000r/min,离心时间15-80min;清洗方法为:依次采用稀盐酸、乙醇和水反复清洗,其中稀盐酸的浓度为0.1-5mol/L,乙醇的体积百分浓度为70%~80%;冷冻干燥方法为:干燥温度为-20~-80°C,真空度≤160Pa,干燥时间为12-24h。有益效果:本发明方法与现有技术相比具有如下优势:1、本法利用食品安全,生长条件温和的枯草芽孢杆菌对氧化石墨烯进行还原,通过枯草芽孢杆菌分泌的还原酶及其电子传递特性,同时利用外加电子介体维生素K₃,使其更好的进行电子传输,实现氧化石墨烯的还原。与过往技术相比,本法制得的石墨烯的拉曼光谱中,G峰红移更远,达到1569cm^-1。可以看出与过往技术相比,本法降低了石墨烯的结构缺陷,最大限度的保持了石墨烯原有的优异特性。2、与过往技术相比,本方法的一大优势在于反应迅速,耗时短。本方案中所用的枯草芽孢杆菌经过夜活化,反应0.5h后就有很明显的现象,10h后即可基本反应完全。且本发明方案中所用的枯草芽孢杆菌直接接种于培养基活化即可,无需做其它处理,步骤简单。
附图说明
图1是本发明所公开的工艺的流程示意图。图2a是本发明实施例1生物催化制备石墨烯的效果对比图(I空白氧化石墨烯,IIVK₃还原氧化石墨烯,III微生物还原氧化石墨烯,IV微生物和VK₃共同还原氧化石墨烯,反应时间均为5min)。图2b是本发明实施例1生物催化制备石墨烯的效果对比图(I空白氧化石墨烯,IIVK₃还原氧化石墨烯,III微生物还原氧化石墨烯,IV微生物和VK₃共同还原氧化石墨烯,反应时间均为30min)。图2c是本发明实施例1生物催化制备石墨烯的效果对比图(I空白氧化石墨烯,IIVK3还原氧化石墨烯,III微生物还原氧化石墨烯,IV微生物和VK₃共同还原氧化石墨烯,反应时间均为10h)。图3是本发明实施例1生物催化制备石墨烯的OD₆₀₀对比图。图4是本发明实施例1生物催化制备石墨烯的拉曼光谱对比图。图5a~5d是本发明实施例1生物催化制备石墨烯的XRD对比图。其中,图5a是空白氧化石墨烯,图5b是VK₃还原氧化石墨烯,图5c是微生物还原氧化石墨烯,图5d是微生物和VK₃共同还原氧化石墨烯,反应时间均为10h。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1本发明一种生物催化制备石墨烯,包括以下制备步骤:第一步,细菌悬浮液的制备。将活化好的枯草芽孢杆菌B168进行离心收集菌体,10000r/min转速离心10min。用灭过菌的基本培养基M9重悬,再次离心收集菌体,10000r/min转速离心10min,以去除原有的培养基。重复以上操作一次。最后用M9培养基重悬,并调节OD=0.5。其中枯草芽孢杆菌培养基中包括:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl10g/L,可溶性淀粉10g/L。M9培养基中包括:Na₂HPO₄·7H₂Oxa012.8g/L,K₂HPO₄3g/L,NaCl0.5g/L,NH₄Cl1g/L,MgSO₄0.24g/L,CaCl₂0.0111g/L,葡萄糖4g/L。。其中的MgSO₄、CaCl₂、葡萄糖要和其他成分分开灭菌。所有的培养基选用高压灭菌锅121°C,蒸汽压为0.1MPa,灭菌时间15min。第二步,VK₃溶液的配置。准确称取10mgxa0VK₃粉末到灭过菌的50mL的洁净离心管中,加入10mL无水乙醇,振荡混匀,使其充分溶解。第三步,氧化石墨烯预处理。称取0.055g单层氧化石墨烯片状固体到灭过菌的50mL的洁净离心管中,加入10mL灭过菌的去离子水。在250W的超声波清洗机中,于室温下超声处理至氧化石墨烯全溶,得到分散性能较好的氧化石墨烯棕色悬浮液。第四步,向灭过菌的25mL的厌氧小瓶子中加入9.5mL第一步中制备的细菌悬浮液,加入10μL第二步中制备的VK₃,再加入0.5mL第三步中制备的氧化石墨烯悬浮液,混匀。每瓶通入3min的N₂,以除去溶解氧。在室温静置10h,进行生物催化反应。并适时取样,时刻观察反应过程中OD₆₀₀的变化过程。第五步,将第四步生物催化完毕的反应液静置,10000r/min转速离心30min;向获得的混合物沉淀中加入1mol/L稀盐酸100mL,搅拌均匀,室温下静置1h;以10000r/min转速离心30min,倾去上清液,用80%乙醇溶液清洗沉淀,搅拌均匀,室温下静置1h,10000r/min转速离心30min,倾去上清液,最后用去离子水清洗沉淀,如上重复3次,最后用去离子水洗到中性为止,将沉淀置于真空冷冻干燥箱中,-50°C,真空度≤160Pa,干燥时间为24h,得到纯净的石墨烯。如图2所示,同时添加了枯草芽孢杆菌B168和VK₃的样品瓶中氧化石墨烯悬浮液基本全部变黑,且有黑色颗粒物质析出,而两者都不添加或只添加其中一种的样品瓶中没有很大变化,说明枯草芽孢杆菌B168和VK₃共同作用下,氧化石墨烯得到了很好的还原。而且在反应0.5h时,效果已经非常明显。通过适时取样,测定OD₆₀₀的吸光度值得到的变化曲线如图3所示,从图中明显可以看出,在反应初期,OD₆₀₀值迅速上升,说明反应速度很快,反应到10小时时,OD₆₀₀值基本不再变化,反应基本结束。对得到的枯草芽孢杆菌B168和VK₃共同还原的氧化石墨烯进行拉曼光谱测试,结果如图4所示。同时添加了枯草芽孢杆菌B168和VK₃催化还原氧化石墨烯制备的石墨烯在1350cm^-1和1569cm^-1左右分别出现了D峰和G峰两个特征峰。与用希瓦氏菌还原制备的石墨烯(见参考文献Gongmingxa0Wang,Fangxa0Qian,Chadxa0W.Saltikov,Yongqinxa0Jiao.Microbialxa0Reductionxa0ofxa0Graphenexa0Oxidexa0byxa0Shewanella.Nanoxa0Res.2011,4(6):563–570)相比,D/G明显要小,表明枯草芽孢杆菌催化还原氧化石墨烯制备的石墨烯具有较低的缺陷和无序性。图5为本发明得到的石墨烯的XRD图,从图中可以看出,枯草芽孢杆菌B168和VK₃共同作用的情况下,氧化石墨烯被还原的效果最好。实施例2一种生物催化制备石墨烯的方法,包括以下制备步骤:第一步,细菌悬浮液的制备。将活化好的枯草芽孢杆菌B168进行离心收集菌体,10000r/min转速离心10min。用灭过菌的基本培养基M9重悬,再次离心收集菌体,10000r/min转速离心10min,以去除原有的培养基。重复以上操作一次。最后用M9培养基重悬,并调节OD=0.5。其中枯草芽孢杆菌培养基中包括:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl10g/L,可溶性淀粉10g/L。M9培养基中包括:Na₂HPO₄·7H₂Oxa012.8g/L,K₂HPO₄3g/L,NaCl0.5g/L,NH₄Cl1g/L,MgSO₄0.24g/L,CaCl₂0.0111g/L,葡萄糖4g/L。其中的MgSO₄、CaCl₂、葡萄糖要和其他成分分开灭菌。所有的培养基选用高压灭菌锅121°C,蒸汽压为0.1MPa,灭菌时间15min。第二步,VK₃溶液的配置。准确称取10mgxa0VK₃粉末到灭过菌的50mL的洁净离心管中,加入10mL无水乙醇,振荡混匀,使其充分溶解。第三步,氧化石墨烯预处理。称取0.055g单层氧化石墨烯片状固体到灭过菌的50mL的洁净离心管中,加入10mL灭过菌的去离子水。在250W的超声波清洗机中,于室温下超声处理至氧化石墨烯全溶,得到分散性能较好的氧化石墨烯棕色悬浮液。第四步,向灭过菌的25mL的厌氧小瓶子中加入9.5mL第一步中制备的细菌悬浮液,加入10μL第二步中制备的VK₃,再加入0.5mL第三步中制备的氧化石墨烯悬浮液,混匀。每瓶通入3min的N₂,以除去溶解氧。在室温静置0.5h,进行生物催化反应。第五步,将第四步生物催化完毕的反应液静置,10000r/min转速离心30min;向获得的混合物沉淀中加入1mol/L稀盐酸100mL,搅拌均匀,室温下静置1h;以10000r/min转速离心30min,倾去上清液,用80%乙醇溶液清洗沉淀,搅拌均匀,室温下静置1h,10000r/min转速离心30min倾去上清液,最后用去离子水清洗沉淀,如上重复3次,最后用去离子水洗到中性为止,将沉淀置于真空冷冻干燥箱中,-50°C,真空度≤160Pa,干燥时间为24h,得到纯净的石墨烯。实施例3本发明一种生物催化制备石墨烯,包括以下制备步骤:第一步,细菌悬浮液的制备。将活化好的枯草芽孢杆菌B168进行离心收集菌体,10000r/min转速离心10min。用灭过菌的基本培养基M9重悬,再次离心收集菌体,10000r/min转速离心10min,以去除原有的培养基。重复以上操作一次。最后用M9培养基重悬,并调节OD=0.5。其中枯草芽孢杆菌培养基中包括:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl10g/L,可溶性淀粉10g/L。M9培养基中包括:Na₂HPO₄·7H₂Oxa012.8g/L,K₂HPO₄3g/L,NaCl0.5g/L,NH₄Cl1g/L,MgSO₄0.24g/L,CaCl₂0.0111g/L,葡萄糖4g/L。其中的MgSO₄、CaCl₂、葡萄糖要和其他成分分开灭菌。所有的培养基选用高压灭菌锅121°C,蒸汽压为0.1MPa,灭菌时间15min。第二步,VK₃溶液的配置。准确称取10mgxa0VK₃粉末到灭过菌的50mL的洁净离心管中,加入10mL无水乙醇,振荡混匀,使其充分溶解。第三步,氧化石墨烯预处理。称取0.055g单层氧化石墨烯片状固体到灭过菌的50mL的洁净离心管中,加入10mL灭过菌的去离子水。在250W的超声波清洗机中,于室温下超声处理至氧化石墨烯全溶,得到分散性能较好的氧化石墨烯棕色悬浮液。第四步,向灭过菌的25mL的厌氧小瓶子中加入19mL第一步中制备的细菌悬浮液,加入20μL第二步中制备的VK₃,再加入1mL第三步中制备的氧化石墨烯悬浮液,混匀。每瓶通入3min的N₂,以除去溶解氧。在室温静置10h,进行生物催化反应。第五步,将第四步生物催化完毕的反应液静置,10000r/min转速离心30min;向获得的混合物沉淀中加入1mol/L稀盐酸100mL,搅拌均匀,室温下静置1h;以10000r/min转速离心30min,倾去上清液,用80%乙醇溶液清洗沉淀,搅拌均匀,室温下静置1h,10000r/min转速离心30min倾去上清液,最后用去离子水清洗沉淀,如上重复3次,最后用去离子水洗到中性为止,将沉淀置于真空冷冻干燥箱中,-50°C,真空度≤160Pa,干燥时间为24h,得到纯净的石墨烯。实施例4本发明一种生物催化制备石墨烯,包括以下制备步骤:第一步,细菌悬浮液的制备。将活化好的枯草芽孢杆菌B168进行离心收集菌体,10000r/min转速离心10min。用灭过菌的基本培养基M9重悬,再次离心收集菌体,10000r/min转速离心10min,以去除原有的培养基。重复以上操作一次。最后用M9培养基重悬,并调节OD=1.0。其中枯草芽孢杆菌培养基中包括:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl10g/L,可溶性淀粉10g/L。M9培养基中包括:Na₂HPO₄·7H₂Oxa012.8g/L,K₂HPO₄3g/L,NaCl0.5g/L,NH₄Cl1g/L,MgSO₄0.24g/L,CaCl₂0.0111g/L,葡萄糖4g/L。其中的MgSO₄、CaCl₂、葡萄糖要和其他成分分开灭菌。所有的培养基选用高压灭菌锅121°C,蒸汽压为0.1MPa,灭菌时间15min。第二步,VK₃溶液的配置。准确称取10mgxa0VK₃粉末到灭过菌的50mL的洁净离心管中,加入10mL无水乙醇,振荡混匀,使其充分溶解。第三步,氧化石墨烯预处理。称取0.055g单层氧化石墨烯片状固体到灭过菌的50mL的洁净离心管中,加入10mL灭过菌的去离子水。在250W的超声波清洗机中,于室温下超声处理至氧化石墨烯全溶,得到分散性能较好的氧化石墨烯棕色悬浮液。第四步,向灭过菌的25mL的厌氧小瓶子中加入9.5mL第一步中制备的细菌悬浮液,加入10μL第二步中制备的VK₃,再加入1mL第三步中制备的氧化石墨烯悬浮液,混匀。每瓶通入3min的N₂,以除去溶解氧。在室温静置10h,进行生物催化反应。第五步,将第四步生物催化完毕的反应液静置,10000r/min转速离心30min;向获得的混合物沉淀中加入1mol/L稀盐酸100mL,搅拌均匀,室温下静置1h;以10000r/min转速离心30min,倾去上清液,用80%乙醇溶液清洗沉淀,搅拌均匀,室温下静置1h,10000r/min转速离心30min倾去上清液,最后用去离子水清洗沉淀,如上重复3次,最后用去离子水洗到中性为止,将沉淀置于真空冷冻干燥箱中,-50°C,真空度≤160Pa,干燥时间为24h,得到纯净的石墨烯。实施例5本发明一种生物催化制备石墨烯,包括以下制备步骤:第一步,细菌悬浮液的制备。将活化好的枯草芽孢杆菌B168进行离心收集菌体,10000r/min转速离心10min。用灭过菌的基本培养基M9重悬,再次离心收集菌体,10000r/min转速离心10min,以去除原有的培养基。重复以上操作一次。最后用M9培养基重悬,并调节OD=0.2。其中枯草芽孢杆菌培养基中包括:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl10g/L,可溶性淀粉10g/L。M9培养基中包括:Na₂HPO₄·7H₂Oxa012.8g/L,K₂HPO₄3g/L,NaCl0.5g/L,NH₄Cl1g/L,MgSO₄0.24g/L,CaCl₂0.0111g/L,葡萄糖4g/L。其中的MgSO₄、CaCl₂、葡萄糖要和其他成分分开灭菌。所有的培养基选用高压灭菌锅121°C,蒸汽压为0.1MPa,灭菌时间15min。第二步,VK₃溶液的配置。准确称取10mgxa0VK₃粉末到灭过菌的50mL的洁净离心管中,加入10mL无水乙醇,振荡混匀,使其充分溶解。第三步,氧化石墨烯预处理。称取0.055g单层氧化石墨烯片状固体到灭过菌的50mL的洁净离心管中,加入10mL灭过菌的去离子水。在250W的超声波清洗机中,于室温下超声处理至氧化石墨烯全溶,得到分散性能较好的氧化石墨烯棕色悬浮液。第四步,向灭过菌的25mL的厌氧小瓶子中加入19mL第一步中制备的细菌悬浮液,加入20μL第二步中制备的VK₃,再加入1mL第三步中制备的氧化石墨烯悬浮液,混匀。每瓶通入3min的N₂,以除去溶解氧。在室温静置0.5h,进行生物催化反应。第五步,将第四步生物催化完毕的反应液静置,10000r/min转速离心30min;向获得的混合物沉淀中加入1mol/L稀盐酸100mL,搅拌均匀,室温下静置1h;以10000r/min转速离心30min,倾去上清液,用80%乙醇溶液清洗沉淀,搅拌均匀,室温下静置1h,10000r/min转速离心30min倾去上清液,最后用去离子水清洗沉淀,如上重复3次,最后用去离子水洗到中性为止,将沉淀置于真空冷冻干燥箱中,-50°C,真空度≤160Pa,干燥时间为24h,得到纯净的石墨烯。